3.1 大肠杆菌中L-缬氨酸生物合成途径的增强

在这项研究中，大肠杆菌W3110被选为起始菌株，用于L-缬氨酸的生物合成。大肠杆菌W3110中的lacI基因被删除，以获得在Ptrc启动子下的基因的组成式表达。L-缬氨酸的支链合成从丙酮酸开始，通过四个酶的催化进行，由ilvBN/ilvGM/ilvIH、ilvC、ilvD和ilvE编码的四种酶进行催化。在这些酶中，限速酶AHAS以前被证明是被L-缬氨酸反馈抑制的。据报道， ilvBN操作子通常被选择用于扩增L-缬氨酸的合成，但其表达受L-缬氨酸和L-亮氨酸的衰减控制，并且非常易受L-缬氨酸反馈抑制的影响。为了获得高效的L-缬氨酸生产，通常需要对ilvBN进行突变。

除了本地AHAS的突变外，引入异源基因也有可能减轻对L-缬氨酸的影响并缓解衰减和反馈抑制的作用。在这项研究中，我们测试了两个异源AHASs在大肠杆菌W3110中的表达。用于合成乙酰乳酸合成酶有两种：乙酰羟基酸合成酶（AHAS）和乙酰乳酸合酶（ALS）。将来自谷氨酸棒杆菌工程菌的ilvBN基因和来自枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS被分别置于强Ptrc启动子下，并引入到大肠杆菌W3110 ΔlacI的假基因ycdN位点上，从而得到菌株VHY01和VHY02。VHY01和VHY02的摇瓶发酵，以大肠杆菌W3110为对照。在野生型大肠杆菌W3110中几乎没有L-缬氨酸的积累，而VHY01和VHY02中的L-缬氨酸产量在24小时内分别达到0.30g/L和4.65g/L。VHY02表现出最高的L-缬氨酸产量，而细胞生物量最低，这表明alsS的引入成功地将更多的碳源从丙酮酸转到L-缬氨酸的合成中，而不是流向TCA循环。因此，菌株VHY02被选择用于进行进一步的工程设计。

我们通过在VHY02中引入更多的AlsS的拷贝来进一步增强其表达。在Ptrc启动子的控制下，另一个或两个alsS拷贝被整合到VHY02中，从而产生了菌株VHY03和VHY04。与VHY02相比，VHY03中L-缬氨酸的产量增加了126%，达到10.50 g/L，并且该菌株的产量提高了130.6%，达到0.10克/克葡萄糖。进一步增加alsS拷贝数并没有增加VHY04的L-缬氨酸产量。菌株VHY04中L-缬氨酸产量没有增加，这表明两个alsS拷贝对支链的合成是足够有效的。在合成途径中非限速基因的过量表达也可能提高目标化学物质的合成。因此，我们接下来在启动子P.C.的作用下，单独与ilvC一起过量表达ilvED操作子。在VHY03的启动子Ptrc下分别与ilvED和ilvC一起过表达，分别产生菌株VHY05和VHY06。摇瓶发酵结果显示表明，同时过量表达非限速的ilvED和ilvC基因在VHY06中明显提高了L-缬氨酸的产量，在24小时内生产了18.60克/升L-缬氨酸，产量为0.17克/克葡萄糖。

3.3 丙酮酸库的富集

除了通过加强L-缬氨酸分支合成的 "拉动 "策略和L-缬氨酸的输出策略之外，前体库的富集将为L-缬氨酸的合成提供一个强大的 "推动 "动力。丙酮酸是中央碳代谢的一个关键节点，是L-缬氨酸的一个重要前体。增加葡萄糖摄取过程已被证明是有效地增加丙酮酸库。两个具有相似结构的蛋白质RelA和SpoT，在营养饥饿时具有活性，以调节(p)ppGpp的合成和水解。正如Michalowski等人所报告的，敲除relA编码的GTP焦磷酸激酶，并引入一个突变的spoT基因编码的ppGpp 3′-焦磷酸水解酶可以严格的反应调节程序，并加强摄取葡萄糖的过程。我们分别测试了删除relA基因和在Ptrc启动子控制下过量表达spoT基因，在VHY10的yeep基因座上的Ptrc启动子的控制下，分别构建了菌株VHY12和VHY13。与VHY10相比，VHY12中的relA基因的缺失对L-缬氨酸的合成是不利的。相反，在VHY13中过量表达spoT，增加了L-缬氨酸的合成。VHY13中L-缬氨酸产量增加到39.10 g/L而不损害细胞的生长，表明流入丙酮酸池的碳通量增加，并随后进入L-缬氨酸的合成。

在计算后发现，在VHY13菌株的发酵过程中比VHY10菌株的发酵过程中多输入了16.7%的葡萄糖。同时，两株菌株的发酵液中的葡萄糖浓度在24小时内相似，这表明VHY13菌株对葡萄糖的摄取得到了加强。

除了从糖酵解中合成外，丙酮酸也可以从TCA循环中得到补充。因此，我们也测试了maeA和maeB基因的过量表达，这两个基因在大肠杆菌中负责从苹果酸转化为丙酮酸。摇瓶发酵的结果表明，在VHY13中过量表达maeA或maeB基因并没有增加大肠杆菌从苹果酸到丙酮酸的转化，也没有增加L-缬氨酸的转化率或产量，同时也没有改变细胞的生物量。这很可能是由于苹果酸脱氢酶的可逆催化作用。除了加强丙酮酸的合成外，我们还试图富集丙酮酸的含量。通过减少丙酮酸在TCA循环中的消耗来充实丙酮酸库，这是L-缬氨酸合成的主要竞争。丙酮酸在TCA循环中的消耗是通过在丙酮酸脱氢酶的催化下形成乙酰CoA来实现的。我们整合了Ptrc控制的aceE基因，该基因在VHY13的yeep基因座上能有效地降低丙酮酸脱氢酶的活性，摇瓶发酵的结果表明，这种策略对L-缬氨酸的生产有不利影响。

3.5 通过两阶段有氧-限氧发酵提高L-缬氨酸产量

尽管VHY 14菌株达到了41.20克/升L-缬氨酸的产量，但产量（0.33克/克葡萄糖）仍然远远低于理论转化率。在TCA循环中，丙酮酸的消耗是通过丙酮酸脱氢酶催化的乙酰CoA的形成是在L-缬氨酸的合成中对丙酮酸供应的主要竞争。如果TCA循环可以被阻断或减弱，例如在氧气限制的情况下发酵，更多的丙酮酸可以被引导到L-缬氨酸的合成中去而不是用于细胞的新陈代谢，从而提出了一种增加L-缬氨酸产量的有希望的方法。

在这项研究中，我们试图使用两阶段的有氧-限氧发酵法来实现L-缬氨酸的高产。用大肠杆菌VHY01-VHY13菌株直接进行两阶段发酵以实现高效的L-缬氨酸生产，结果表明：VHY01-VHY13菌株不能直接通过进行两阶段发酵来有效地生产L-缬氨酸，因为在限氧条件下，由于辅助因子失衡的原因，几乎没有生产L-缬氨酸。同时我们还测试了VHY14在密封管中限氧发酵下的性能。而在类似的限氧条件下，L-缬氨酸的生产很差，这表明在限氧条件下，pntAB介导的辅助因子的再生并不有效，这可能是由于在NADPH的再生过程中需要耦合ATP，而在限氧发酵TCA减弱的情况下，ATP的供应可能不足，当TCA在限氧条件下被削弱时，NADPH的供应可能不充分，导致发酵时其供应不足。在这种情况下，辅助因子的供应将成为L-缬氨酸合成在限氧发酵条件下的主要瓶颈。

即使在限氧发酵的情况下，NADH的供应也可能通过糖酵解保持稳定，甚至可能过度生产。另一种策略是将分支合成的辅助因子需求从NADPH改为NADH，以实现整体的辅助因子再平衡。因此，我们以菌株VHY13为起始菌株测试了这一策略。为了避免在限氧条件下丙酮酸的竞争性消耗，在VHY13中敲除编码乳酸脱氢酶的ldhA基因、编码丙酮酸甲酸裂解酶I的pflB基因和编码乙醇脱氢酶的adhE基因，得到结果是VHY16。Hasegawa等人（2012）报道了S34G，L48E和R49F的突变改变了谷氨酸酶的辅助因子AHAIR从NADPH变为NADH，带电的氨基酸残基改为带负电的。

同样地，我们将ilvC基因中的L67E、R68F和K75E突变，即ilvCM来改变大肠杆菌中AHAIR从NADPH变为NADH对辅助因子的依赖。VHY16中的ilvC基因的原生拷贝和添加拷贝被Ptrc-ilvCM取代，从而产生了VHY17。在Ptrc启动子下，我们进一步引入了由枯草芽孢杆菌的bcd编码的L-亮氨酸脱氢酶，取代VHY17中ilvE编码的转氨酶，以改变L-缬氨酸合成的最后一步从NADPH转化为NADH对辅助因子的依赖性，从而形成VHY18。在这个设计过程糖酵解中产生的NADH可以直接用于L-缬氨酸的合成，从而使辅助因子的再生更加有效。

为了检验上述设计对辅助因子再生的合理性，我们比较了菌株VHY13、VHY14、VHY16、VHY17和VHY18在限氧条件下的发酵特性。第一次在摇瓶中有氧条件下培养16小时后，将细胞转移到含有葡萄糖的缓冲溶液的密封管中。在限氧条件下，测定了4小时后细胞中的NADH/NAD+比率、葡萄糖的消耗、L-缬氨酸的产量和副产物琥珀酸辅助物的积累。VHY13、VHY14、VHY16和VHY17菌株的L-缬氨酸产量相似，但菌株VHY18的L-缬氨酸产量明显更高。与VHY13相比，VHY14中pntAB的增强并没有对NADH/NAD+比率和L-缬氨酸的产量带来很大的变化。然而，葡萄糖的消耗量增加了36.7%，其中主要副产品的数量增加了2.5%。主要副产物琥珀酸的消耗量减少了20.6%。

这些结果表明，pntAB的过量表达可以促进糖酵解，因此，应增加糖酵解产生的NADH。由于VHY14中的NADH/NAD+比率与VHY13中的相似，并且在副产物琥珀酸的合成中消耗的NADH较少，因此可以推断，某些NADH必须用于NADPH的再生。但是L-缬氨酸的合成仍然很差，这说明在限氧条件下，通过PntAB的转化进行的NADPH再生是不够的。与VHY13相比，删除adhE,ldhA和pflB基因（菌株VHY16），使NADH/NAD+的比率增加了22.7%，这与相关NADH消耗途径的阻断是一致的。但由于这些基因的缺失，葡萄糖的消耗量下降了19.8%，副产品琥珀酸的含量也随之增加了。在VHY17中用ilvCM取代ilvC后，NADH/NAD+比率、葡萄糖消耗量和L-缬氨酸产量都没有什么变化。而在VHY18中用bcd取代ilvE后，NADH/NAD+比率明显下降到1.10±0.52，这表明额外的NADH很容易被用于L-缬氨酸的合成，这与它增加的葡萄糖消耗和高L-缬氨酸产量相一致。综上所述，这些结果表明，菌株VHY18通过改变ilvC和ilvE的辅助因子依赖性，在限氧条件下表现出高效的辅因子再生能力，以用于合成L-缬氨酸。

3.6  5L生物反应器中的两阶段好氧-限氧发酵

在5L生物反应器中，对菌株VHY18的两阶段好氧-限氧发酵进行了优化。细胞首先被培养在有氧发酵下，当细胞生物量积累到OD600值为100左右时，停止通风，并将好氧发酵转为限氧发酵。我们比较了在5L生物反应器中VHY18的有氧发酵和两阶段的好氧-限氧发酵。VHY18在有氧发酵过程中的L-缬氨酸浓度、产量和生产率分别为86克/升，0.33克/克葡萄糖和1.95克/升/小时。

相比之下，在两阶段发酵的第一个有氧阶段发酵过程中，L-缬氨酸的产量为0.31克/克葡萄糖，在接下来的限氧阶段，L-缬氨酸的产量更高，达到0.46克/克葡萄糖，使L-缬氨酸的总产量达到了迄今为止报道的最高值（0.41 g/g 葡萄糖）。两阶段发酵下的L-缬氨酸总浓度为84克/升，与好氧发酵下产生的量相似，但产量（0.41 g/g葡萄糖）和生产力（2.33 g/L/h）更高。这些结果表明，与好氧发酵相比，在静止期早期固定阶段（约16小时）转为限氧发酵可以有效地减少细胞生物量，提高L-缬氨酸产量。因此，VHY18菌株的两阶段发酵在L-缬氨酸的合成方面更有效率，并具有巨大的工业应用潜力。

然而值得注意的是在两阶段发酵下，副产物琥珀酸仍然积累到27克/升，这表明大部分丙酮酸和NADH通过还原性TCA循环被消耗掉了，这对L-缬氨酸的产量是不利的。当大肠杆菌细胞在厌氧条件下培养时，细胞的代谢主要是通过糖酵解来维持。通过这个过程产生丙酮酸和NADH。为了获得辅助因子的平衡，产生的NADH必须能够被氧化成NAD+，否则过多的NADH会抑制葡萄糖的消耗和细胞的生长。在大肠杆菌的厌氧发酵过程中，糖酵解产生的NADH可以通过从丙酮酸转化为乳酸、琥珀酸、乙醇、甲酸等被氧化。

因此，这些过程构成了主要的与L-缬氨酸合成的竞争。由于直接竞争的途径消耗丙酮酸的竞争途径已经通过敲除adhE、ldhA和pflB基因阻断了直接消耗丙酮酸的竞争途径，通过还原性TCA循环形成琥珀酸消耗丙酮酸，成为合成L-缬氨酸的主要竞争者。为了减少旁路消耗，我们敲除了frdABC基因来阻断琥珀酸通过还原性TCA循环的合成。然而，观察到由于frdABC基因的缺失，L-缬氨酸的产量和转化率都有所下降。这表明直接阻断还原性TCA循环对L-缬氨酸的合成是不利的。在frdABC敲除的菌株中产生了6.2 g/L的苹果酸，而不是在发酵液中积累大量的琥珀酸，其形成也消耗了丙酮酸。

在本研究中，通过多步骤的代谢工程策略，开发了一种高产L-缬氨酸的大肠杆菌菌株。多步骤的代谢工程策略，包括（1）加强L-缬氨酸的合成途径；（2）修饰L-缬氨酸外排系统；（3）丙酮酸库的富集；（4）改变氧化还原辅助因子的平衡。通过采用一种新型的两阶段分批发酵策略，实现了L-缬氨酸的高产量（84克/升）和高转化率（0.41克/克葡萄糖）。