绿色添加剂溶菌酶及其应用

2019-05-09

溶菌酶(lysozyme,ec3.2.1.17)又称细胞壁质酶(muramidase)或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmuramideglycanohydralase)。1922年英国细菌学家a.fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解(solubility)细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。此后在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入,发现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶,还有作用于真菌细胞壁的种类,同时对其作用机制也有了更进一步的了解。近几年,人们根据溶菌酶的溶菌特性,将其应用于医疗、食品防腐、畜牧及生物工程中,具有一定的应用价值。
  溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种,一种是作用于β-1,4糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽 ;尾 ;和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌(moulds)细胞壁溶解酶。
  溶菌酶(Enzyme)广泛地分布于自然界中,在人的组织及分泌物中可以找到,动物组织中也有,以鸡蛋清中含量最多。其它植物组织及微生物细胞中也存在。根据来源不同,其性质及作用机制略有差异。
  鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%~3.5%,作为溶菌酶类的典型代表,是目前重点研究的对象,也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18种129个氨基酸残基组成,具有4个s-s键,分子量为14000,等电点为11.1,最适温度(temperature)为50℃,最适ph值为6~7,其化学性质非常稳定,在ph1.2~11.3范围(fàn wéi)内剧烈变化时,结构仍稳定不变。遇热也很稳定,在ph4~7、100℃处理1min不失活,是一种稳定的碱性蛋白质,但在碱性条件下对热稳定性较差。
  其它鸟类如鹌鹑、珍珠鸡、火鸡等的蛋清中也分离纯化出溶菌酶(Enzyme),与鸡蛋清溶菌酶活性非常相似,也由129个氨基酸组成,虽排列顺序有所不同,但活性部位的氨基酸排列则大体相同。
  人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中,1ml眼泪中含7mg溶菌酶,1ml乳汁中含0.1~0.5mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成,有4个s-s键,分子量为14600,其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。
  对于哺乳动物溶菌酶,目前已从牛、猪、猫、兔、猴、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶,其化学性质与人溶菌酶相似,但结构尚不清楚,其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3000倍。曾林(1999)采用琼脂平板法测定家兔初乳溶菌酶含量。结果表明:初乳溶菌酶含量为(7.96±2.01)μg/ml,常乳溶菌酶含量(5.01±1.32)μg/ml。人及哺乳动物溶菌酶的作用(role)机制与鸡蛋清溶菌酶相同。
  目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶,其分子量较大,约为24000~29100。细胞工程展淀粉粒为水不溶性的半晶质,在偏振光下呈双折射。淀粉粒的形状(有卵形、球形、不规则形)和大小(直径1~175μm)因植物来源而异。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3,但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。周泽文(1994)从菜心分离溶菌酶表明,酶比活力达3414.6u/mg,纯化倍数为197.4。菜心溶菌酶在较宽的温度和ph植范围内均有活性,最适温度为60℃,最适ph值为5.8。高向阳(1997)研究了萝卜溶菌酶对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆3种革兰氏阳性菌和变形菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、多杀巴斯德氏杆菌、雏白痢沙门氏菌、产气杆菌6种革兰氏阴性菌及酿酒酵母、总状毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5种真菌的抑菌效果。同时还研究了萝卜溶菌酶对白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌及烟草青枯病菌6种植物病原细菌的抑菌效果。试验证明:萝卜溶菌酶对上述参试的菌种都有不同程度的抑菌作用(role)。
  目前微生物产生的溶菌(fungus)酶分为7类:
  ①内n-乙酰已糖胺酶,此酶同于鸡蛋清溶菌酶,破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键;
  ②酰胺(acylamide)酶,切断(割开;截断)细菌细胞壁肽聚糖中nam与肽 ;尾 ;之间的n-乙酰胞壁酸-l-丙氨酸键;
  ③内肽酶,使肽 ;尾 ;及肽 ;桥 ;内的肽键断裂;
  ④β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,此酶分解酵母(释义(酵母菌)细胞的细胞壁;
  ⑤壳多糖酶,与葡聚糖酶共同作用,可分解霉菌(moulds)和酵母;
  ⑥磷酸甘露糖酶,与葡甘露糖酶共同作用,可分解原生质;
  ⑦脱乙酰壳多糖酶,主要分解毛霉和根霉。
  该酶是一种特异性的酶,由噬菌体感染、诱导产生,但未被感染的宿主细胞上不存在该酶。
  溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶,此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一,该酶能催化水解细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。酶制剂展交联淀粉的概念是,淀粉的醇羟基与交联剂的多元官能团形成二醚键或二酯键,使两个或两个以上的淀粉分子之间“架桥”在一起,呈多维网络结构的反应,称为交联反应。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌,在分泌型免疫球蛋白
  A、补体的参与下,还能水解革兰氏阴性菌(fungus)如大肠杆菌等。此外,它还可与各种诱发炎症的酸性(acidity)物质结合,使其失活,并能增强抗生素和其它药物的疗效,改善组织基质的粘多糖代谢,从而达到消炎、修复组织的目的。
  梁爱华(2001)考察在不同温度下鸡蛋清溶菌酶与β-内酰胺类抗生素联合应用对大肠埃希氏菌的生长及内毒素释放的影响。结果:在不同的培养温度下,氨苄西林或头孢噻肟50μg/ml均可导致细菌溶解,并诱导escherichiacoli释放大量的内毒素到培养上清液中,这些培养上清液在体外培养的巨噬细胞上可诱导大量的肿瘤坏死因子(tnfα)和白细胞介素6(il-6)产生。而鸡蛋清溶菌酶与β-内酰胺类抗生素联合使用能阻止细菌溶解,降低细菌内毒素的释放,并减少巨噬细胞tnf-和il-6的产生。
  溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,与dn
  A、rn
  A、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎,尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性,其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长,并能防止疱疹(herpes)性病毒感染。
  溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一,参与机体多种免疫反应,在机体正常防御功能和非特异免疫中,具有保持机体生理平衡的重要作用。可改善和增强巨嗜细胞吞噬和消化功能,激活白细胞吞噬功能,并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少,从而增强机体的抵抗力。
  溶菌酶还具有激活血小板的功能,可以改善组织局部(part)血液循环障碍,分泌脓液,增强局部防卫功能,从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子,对组织局部起保护作用。
  溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖,促进婴儿消化吸收,可以促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化;能够加强血清灭菌蛋白(properdin),γ-球蛋白(γ-globulin)等体内防御因子对感染的抵抗力,特别对早产婴儿有防御体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。基因工程展淀粉可以看作是葡萄糖的高聚体。可由玉米、甘薯、野生橡子和葛根等含淀粉的物质中提取而得。
  细菌的细胞壁由胞壁质组成,胞壁质是由n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetylglucosamine)及n-乙酰胞壁酸(n-acetylmuramicacid)交替组成的多聚物,胞壁酸残基上可以连接多肽,称为肽聚糖(peptidoglycan)。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分,它是由na
  M、nag和肽 ;尾 ;(一般是4个氨基酸)组成,nam与nag通过β-1,4糖苷键相连,肽 ;尾 ;则是通过d-乳酰羧基连在nam的第3位碳原子上,肽尾之间通过肽 ;桥 ;(肽键或少数几个氨基酸)连接,na
  M、na
  G、肽 ;尾 ;与肽 ;桥 ;共同组成了肽聚糖的多层网状结构,作为细胞壁的骨架,上述结构中的任何化学(Chemistry)键断裂,皆能导致特殊结构:荚膜、鞭毛、菌毛细胞壁的损伤。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖,其水解位点是n-乙酰胞壁酸(Acerbity)(nam)的1位碳原子和n-乙酰葡萄糖胺(nag)的4位碳原子间的β-1,4糖苷键,结果使细菌细胞壁变得松弛,失去对细胞的保护作用,最后细胞溶解死亡。
  对于g+细菌与g-细菌,其细胞壁中肽聚糖含量不同,g+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成,而g-细菌只有内壁层为肽聚糖,因此,溶菌酶只能破坏g+细菌的细胞壁,而对g-细菌作用不大。
 
 

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